MC3T3-E1 Hücre Dizisinin Uygulandığı Biyoseramiklerin Taramalı Elektron Mikroskobu ve Konfokal Mikroskop ile İncelenmesi

Abstract

Seramikler, biyouyumlu ve biyoaktif malzemelerdir. Hidroksiapatit (HAP) kemik defekti onanmmda en çok kullanılan biyomalzemelerin başında gelmektedir. Kemik iyileşmesindeki osteokondüktif etkilerinden dolayı HAP hem kütle biyomalzeme halinde hem de biyomalzemelere yüzey kaplaması olarak kullanılmaktadır. HAP hafif bir doku yanıtı oluşturur. Trikalsiyum fosfat (TCP) ise yüksek biyouyumluluğu ve biyodegradasyon özelliklerinden dolayı tercih edilmektedir. Çalışmamızda farklı seramikler fare kalvaryası kökenli preosteoblastlardan elde edilen MC3T3 hücrelerinden 50.000 hücre/cm² olacak şekilde ekilen hücre kültürlerine uygulanmıştır. Uygulanan seramikler: %100 HAP, %100 TCP, %60HAP+%40TCP ve %40HAP+%60TCP karışımlarıdır. Seramik uygulanmış kültürlerden, uygulamadan sonraki 3., 5., 10., 15. ve 21. günlerde konfokal mikroskop (KM) ve SEM (scanning-taramalı elektron mikroskobu) görüntüleri alınmıştır. KM için malzeme üzerindeki canlı hücreler lipofılik fluoresan boyalarla kültür koşullarında inkübe edilmiş; % 2.5’lik gluteraldehit ile 15 dakika fıkse uygun dalga boyunda KM’ta görüntülenmiştir. SEM’da incelenecek örnekler 1.5 saat süre ile % 2.5’lik gluteraldehitle tespit edilerek kurutulup altınla kaplanmıştır. KM ve SEM incelemeleri, hücrelerin 3. günden itibaren malzemeye tutunduğunu ve seramik kompozitleri ile değişen derecelerde uyum içinde olduğunu gösterdi. SEM’da osteoblastlann 10. ve 15. günlerde seramiklere ait gözeneklerin içine ilerleyecek şekilde yüzeye ekstraselüler matriks bileşenlerini salgılamakta olduğu izlendi. Tüm zaman aralıklarında, özellikle HAP+TCP kombinasyon gruplarında biyomalzeme yüzeyindeki hücre sayısının diğer gruplara göre daha fazla olduğu saptandı. Bu gruplarda 10. günden itibaren, yanyana dizili kemik hücrelerinin ağ şeklinde yüzeyi kaplamakta olduğu; hücrelerin arasının ise ara madde ile doldurulduğu dikkati çekti. KM görüntüleri HAP+TCP kompozit seramiklerin MC3T3 hücreleri için daha güçlü osteokondüktif bir matriks oluşturduğunu gösterdi. HAP+TCP seramikler, uygun hücrelerle in vitro ortamda inkübe edildiklerinde elde edilecek hücre-matriks sistemleri, doğru endikasyonlarla kullanıldıklarında in vivo uygulamalar için umut vaadetmektedir.

Ceramics are biocompatible and bioactive materials. Hydroxyapatite(HAP) is among the most frequently used biomaterials for fracture healing. Because of its osteoconductive effects on fracture healing, HAP has been used as a bulk biomaterial as well as a surface coating over other biomaterials. Tricalcium phosphate(TCP) has high biocompatiblity and biodegradation properties. In the present study, different ceramic groups were applied onto MC3T3 cell cultures(50000 cell/cm²) that were derived from mouse calvarian preosteoblasts. Ceramic groups were: 100% HAP, 100% TCP, and composites consisting of 60%HAP+40%TCP or 40%HAP+60%TCP combination. SEM and CM photos were taken from ceramics exposed to cell cultures for durations of 3, 5, 10, 15 and 21 days. Live cells on top of the biomaterails were incubated for 15 minutes with lipophylic florescent dyes(2.5% gluter-aldehyte) for CM. For SEM observations, materials with cells were fixed for 90 minutes with 2.5% gluteraldeyte and then coated with gold. CM and SEM studies revealed that cells were attached to biomaterials with biocompatibility within the third day of in vitro exposure. In SEM, movement of osteoblasts into pores of ceramics on day 10 and 15 with extracellular matrix release were observed. Cell population on ceramics was more dense in HAP+TCP combinations than outher groups in all time periods. In HAP+TCP groups, beginning from day 10, bone cells covered surface of biomaterial as a net. According to CM, the HAP+TCP combination groups made stronger osteoconductive matrices than other groups for MC3T3 cells. This study showed that, cell-matrix systems may provide altenative ways for invivo applications with right indications, if HAP+TCP ceramics were incubated with adequate cells in in vitro cell culture.