DNA ile beslenen aç tetrahymena thermophila hücrelerinde deoksiribonükleaz (DNaz) aktivitesinin gen ifadesi açısından karakterizasyonu

Abstract

Deoksiribonükleazlar, çift ya da tek iplikli DNA moleküllerini kesen dizi bağımsız enzim grubudur. Bu enzimlerin in vivo da, apoptosis sırasında DNA parçalanması ve yabancı DNA’ların hücre içine girişini önlemek gibi çeşitli biyolojik görevleri vardır. In vitro’da ise RNA ve protein izolasyonu gibi rutin laboratuar çalışmalarında DNA kontaminasyonunu önlemek için DNaz kullanılır. Tek hücreli ökaryotik silli Tetrahymena thermophila, sistem ve moleküler biyoloji çalışmalarında yaygın şekilde kullanılan iyi tanımlanmış, ancak DNaz enzimleri yeterince araştırılmamış bir model organizmadır. Yaşam döngüsü; vejetatif, açlık ve konjugasyon olmak üzere üç evreden oluşmaktadır. Son yıllarda Tetrahymena’nın ökaryotik protein üretim konakçısı olmapotansiyelinin artması nedeniyle, DNaz aktivite tanımlamasının yapılması önem arz etmektedir. Çünkü yüksek DNaz aktivitesi bir organizmanın DNA ile transformasyonunu zorlaştıran bir parametredir. Bu tez çalışması kapsamında Tetrahymena genomunda yapılan biyoinformatik taramalarla olası 5 adet DNaz II genlerinin DNaz II’lere özgü katalitik TxDHSKW motifi taşıdığı bulunmuştur. Tetrahymena DNaz II proteinleri ile yapılan filogenetik analizler ise bu grubun yüksek ökaryotların DNaz II’lerine göreatasal karakterler taşıdığını ortaya koymuştur. Deneysel olarak; aç ve vejetatif (tok) Tetrahymena hücrelerinin DNaz aktivite karakterizasyonu toplam protein üzerinden zimogram analizi ile gerçekleştirilmiş ve 28-69 kDa aralığında 5 farklı aktivitebandı belirlenmiştir. Ayrıca maksimum DNaz aktivitesi pH 5.0 civarında görülmüş olup Mg+2 iyonunun pH 7.5’te gözlenen aktivite bantlarını önemli derecede inhibe ettiği bulunmuştur. DNA ile muamele edilmiş aç Tetrahymena hücrelerinde ise zimogram deneyleri, hücre dışına salgılanan 32 kDa’luk bir DNaz aktivite bandında kısmi bir artış meydana geldiğini göstermiştir. Sonuç olarak; gelecekte Tetrahymena’nın ökaryotik rekombinant protein üretim konakçısı olarak yaygın kullanımı, bu çalışma bulguları ile daha kolaylaşmış olacaktır.