Tetrahymena thermophila ligaz enzim ailesi üyelerinden birinin moleküler ve biyoteknolojik karakterizasyonu

Abstract

DNA ligazlar, DNA replikasyonu, tamiri ve rekombinasyonu esnasında meydana gelen DNA kırıklarını tamir ederler. Tüm DNA ligazlar aktif bölgelerinde KxDGxR motifi taşır ve kofaktör ihtiyaçlarına göre NAD ya da ATP bağımlı olup aynı reaksiyon mekanizmasını izler. Tetrahymena thermophila tekhücrelisinde, biyoteknolojik olarak üretilip kullanılan ATP bağımlı T4 DNA ligaz’a alternatif olabilecek bir enzimi belirlemek ve rekombinant olarak üretmek bu tezin amacını oluşturmaktadır. GenBankasında ve Tetrahymena Genom Veritabanınında Tetrahymena thermophila’nın makronüklear genleri içinde yapılan BLAST analizi dört adet DNA ligaz geni bulunduğunu göstermiştir. Bunlardan TtLIG11 ve TtLIG12 verilen üyelerin ökaryotik DNA ligaz I, TtLIG4’ün ökaryotik DNA ligaz IV sınıfına dahil olduğu MEGA4 programı kullanılarak filogenetik analizler ile belirlenmiştir. Son üye olan TtLIG13’ün ise T4 gibi virüs ve prokaryotların ligazlarına benzerlik gösteren fakat sadece omurgasızlarda bulunan bir altsınıfa ait olduğu bulunmuş ve bu guruba Ligaz II adının verilmesi önerilmiştir. DNA ligazlara özgü altı motifi taşıyan Tetrahymena DNA ligaz üyelerinden TtLIG13’ün E. coli’de rekombinant protein olarak ifade edilebilmesi için gerekli 22 nokta mutasyonu PZR ile yerleştirilerek kodon uyumu sağlanmıştır. Rekombinant TtLIG13 cDNA’sı 6XHistidin takısını sağlayan pET16b vektörüne klonlanmış ve E.coli BL21 (DE3) pLysS’e aktarılmıştır. Rekombinant TtLIG13’ün ilk IPTG indüksiyonu gerçekleştirilerek Ni-NTA tanecikleri ile afinitik saflaştırılma denemeleri gerçekleştirilmiş fakat toksik gen grubuna girmesinden dolayı zorluklarla karşılaşılmıştır. Rekombinant TtLig13p’nin üretim ve saflaştırma çalışmaları sürmekte olup biyoteknolojik alternatif ürün potansiyelinin değerlendirmesi bu aşamanın başarılı olması durumunda sonuçlandırılabilecektir.